馬梨形蟲病Piroplasmosis雙重PCR熒光試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：馬梨形蟲病Piroplasmosis雙重核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name   ：Piroplasmosis double nucleic acid detection kit (fluorescence-PCR method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

動物源性成分廣泛分布于食品、飼料、化妝品等，與人們的生活息息相關(guān)，其中食品和飼料所占的比例大。肉及肉制品摻假成為世界各國共同關(guān)注的熱點問題，肉食品及其飼料的安全隱患直接關(guān)系到人類的安危。近幾十年來，以PCR技術(shù)為核心的動物源性成分檢測獲得了廣泛應(yīng)用。

本試劑盒適用于動物組織以及食品、飼料等樣本中馬梨形蟲病Piroplasmosis基因的檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒對馬梨形蟲病Piroplasmosis基因保守區(qū)設(shè)計特異性的引物和探針[1-3]，用熒光PCR技術(shù)對核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，從而達(dá)到快速檢測之目的。

【試劑組成】

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次。有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g。

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用0℃。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理：

取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2DNA 提取

DNA 的提取推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2判斷

a)檢測通道 Ct 值＜30.0，有 FAM 熒光信號檢出，并出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，判斷樣品為陽性。

b)當(dāng) 30.0≤Ct 值≤35.0 時，且有明顯的擴(kuò)增曲線時，則需重復(fù)實驗。再次擴(kuò)增后檢測體系的Ct 值仍≤35.0，且有明顯的擴(kuò)增曲線，則判定該樣品含有相應(yīng)的動物源性成分。當(dāng)再次擴(kuò)增后，檢測體系 Ct 值＞35.0，或無明顯的擴(kuò)增曲線，則判定該樣品不含相應(yīng)的動物源性成分。

6.檢測方法的局限性

1）樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2）樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3）陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4）病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5）不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6）試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或   定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7）本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

a)空白對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

b)陰性對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

c)陽性對照：有 FAM 熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值＜30.0。

d)以上應(yīng)同時滿足，否則本次實驗無效。

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